胚胎干细胞研究中很重要的问题之一是开发一种将胚胎干细胞分化为特定细胞类型的方法。迄今为止，已经开发了几种胚胎干细胞分化方法。很常用的方法涉及使胚胎干细胞聚集形成称为胚状体（EBs）。当除去维持未分化状态的基本因素并在悬浮培养物中培养细胞时，胚胎干细胞自发分化并形成球形聚集体EB。在这些三维构象中，细胞开始相互交叉诱导，迫使它们分化，其方式类似于早期胚胎发生中观察到的。在小鼠胚胎干细胞中，可以通过在没有LIF的情况下创建胰蛋白酶消化的单细胞的悬浮培养物来简单地诱导EB、EB形成后不久，内层样细胞出现在外层。
后来，电子束采用独特的结构，以中间腔为特征。这些独特的构型被称为“囊性EB”，由双层结构，内部外胚层和内部内胚层组成。随着悬浮培养的继续，除了分化的内胚层和外胚层细胞外，中胚层样细胞也开始出现。在人胚胎干细胞中诱导EB形成的方法与在小鼠胚胎干细胞中诱导的方法相当，但是诱导EB的方式取决于研究小组。为了产生EB，可以通过用胶原酶和胰蛋白酶等酶处理来分离人类胚胎干细胞集落，或者将其与饲养细胞进行机械分离。然后将小的分离的团块在细菌分级的平板中培养。
除了通过EB形成进行分化外，还可以通过与特定饲养细胞共培养直接分化胚胎干细胞。这种方法通常用于从胚胎干细胞生成神经元或造血谱系。与基于EB的协议相比，将胚胎干细胞定向到特定谱系更有效。然而，从结果分化的细胞中消除饲养细胞的步骤是必要的，并且与异种污染有关的问题仍然存在。第三种方案是在没有饲养细胞的情况下在限定的底物上单层分化胚胎干细胞。此协议是很简单的协议，它可将影响分化的未知因素的影响降至很低。
1、外胚层分化
在2000年，Lee等人。开发了一种新的基于EB的程序，称为五阶段方法，该程序可将小鼠胚胎干细胞分化为中脑和后脑神经元。为了诱导神经元分化，在EB形成后几天将EB接种到组织培养皿上。然后用化学成分确定的培养基选择神经前体，在bFGF存在下进行扩增，然后通过退出促分裂原结果分化为神经元。相反，在川崎等人开发的共培养方法中。小鼠胚胎干细胞简单地与在无血清培养基中显示出基质细胞诱导活性（SDIA）的PA6饲养细胞一起培养。分化12天后，约50％的总胚胎干细胞分化为Tuj1阳性神经元细胞，约30％的神经元细胞表现出中脑多巴胺能神经元的特征。使用这种共培养方法，再加上信号分子的遗传修饰和处理，小鼠胚胎干细胞中脑多巴胺能神经元的产量显着提高，可达90％。
近期，这些用于小鼠胚胎干细胞神经分化的方案也已经适应于将人类胚胎干细胞分化为神经前体，然后分化为几种不同类型的神经元。通过EB的形成，可以分离出神经前体，这些神经前体可以在存在bFGF的情况下扩展为神经球。这些神经前体进一步分化为运动神经元或多巴胺能神经元，在涉及体内神经发生的正常信号转导基础上。近期，通过产生纯神经球，人类胚胎干细胞诱导了高比例的多巴胺能神经元（我们未发表的观察）。还发现EB的形成，然后用高视黄酸浓度处理并镀在适当的基质上，可诱导神经衍生物的分化。
有一些报道表明，可以通过共培养方法从人胚胎干细胞产生特定类型的神经元。一些实验室已经报道了通过与PA6共培养从人胚胎干细胞衍生多巴胺能神经元的过程。另一篇报道断言，可以通过将人类胚胎干细胞与另一种基质细胞系MS5共培养来诱导神经前体细胞，并且这些细胞可以有效分化为中脑多巴胺能神经元。
此外，长期培养自发分化显示出神经前体的特征形态。机械分离这些细胞并扩增为神经球。也可以使用BMP拮抗剂Noggin或血清加Noggin。近期，有报道称，从人类胚胎干细胞中进行神经诱导后，bFGF和EGF的联合治疗足以使纯神经干细胞衍生和连续扩增，而不再需要特定的细胞生态位。除神经元分化外，少突胶质细胞还通过形成称为“黄色球”的独特结构从人胚胎干细胞中衍生出来。尽管通过这些方案已经产生了神经前体，神经元和少突胶质细胞，但是这些方法仍然需要在效率方面进行改进，并且有待通过体内功能测试加以证实。
2、内胚层分化
由于再生医学领域对这些细胞类型的巨大需求，已经尝试用胚胎干细胞诱导内胚层谱系，例如分化为胰腺β细胞和肝细胞。通过选择培养条件，尝试了从小鼠胚胎干细胞衍生胰腺β细胞和基因改造。但是，由于人类胚胎干细胞难以进行遗传操作，因此已通过EB的形成或长期贴壁培养将其分化为胰腺β细胞，随后进行了胰腺β细胞特异性选择。近期，利用TAT-Pdx1蛋白的蛋白转导技术被用于诱导胰岛素产生细胞。在β细胞分化的情况下，至关重要的是，分化的细胞应表现出与胰岛素产生相关的调节机制。
即使分化的细胞可以产生胰岛素，也可以表达几种β细胞特异性标志物，这些细胞也可能无法满足将其指定为“真正的β细胞”所需要的标准。真正的β细胞不仅表现出产生和分泌胰岛素的能力，而且还响应葡萄糖浓度的变化而改变其细胞机制。否则，分化的细胞仅仅是“产生胰岛素的细胞”。但是，建立β细胞并非易事，小鼠胚胎干细胞实验的结果更具争议性。近期，也有报道说，与肝脏相关的蛋白表达细胞是直接从人胚胎干细胞中产生的。由EB形成或长时间培养后再用丁酸钠处理诱导的人胚胎干细胞衍生物，其形态学特征与原代肝细胞相当，并且还显示出几种肝细胞标记物。
3、中胚层分化
骨骼，肌肉，血液，软骨和结缔组织都来自中胚层发育中的胚胎。由于许多疾病与中胚层谱系细胞的功能障碍有关，因此许多研究小组正在尝试开发将胚胎干细胞有效分化为中胚层谱系细胞的技术。心肌梗死是由明显的心肌细胞死亡。因此，从胚胎干细胞分化出来的心肌细胞可能可以用于心力衰竭的细胞替代治疗。从人类胚胎干细胞成功衍生出心肌细胞，取决于两种EB的形成或共培养，近期有报道。使用这些独特的分化系统，已经分离并鉴定了自发搏动的细胞。这些细胞表达心脏特异性标记物和转录因子，还通过多种功能测试，包括药理学、电生理学和体内评估。
造血细胞也已经衍生自人胚胎干细胞。人类胚胎干细胞已通过EB的形成和细胞因子治疗而被导向造血细胞系。CD34 +细胞也可以通过将胚胎干细胞与骨髓基质细胞共培养获得或卵黄囊内皮细胞。人类胚胎干细胞的造血分化可能通过连续的内皮细胞，原始和确定的阶段来模仿人类卵黄囊的发育。其他中胚层谱系细胞，包括血管内皮细胞，也从人胚胎干细胞中分化出来。分离第 13–15天EB的PECAM1 +细胞，确认内皮细胞特异性基因表达并在体内进行功能检查。
此外，在三维支架中，在人类胚胎干细胞来源的培养物中也观察到了血管生成。除了体细胞分化，近期还报道了小鼠胚胎干细胞可以分化为生殖细胞，卵母细胞和精子。这些细胞表达生殖细胞特异性标志物，并表现出与真实卵母细胞和精子相似的结构。这些报告提供了有关胚胎干细胞分化能力的新信息。但是，尚无关于从人胚胎干细胞诱导生殖系细胞的报道，但一些实验证据表明这是可能的，尽管已经开发出许多将人类胚胎干细胞分化为特定细胞类型的方法，但这项研究仍处于起步阶段，需要大量的时间来优化必要的培养条件。
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