胚胎干细胞培养需要哪些条件

建立人类胚胎干细胞培养的较佳生长条件，然后再进行治疗，这一点至关重要。用于多能人ES细胞的衍生和增殖的技术已经从用于小鼠ES细胞的衍生和培养的方法发展而来。小鼠胚胎干细胞培养初始是在20年前使用免疫外科方法建立的，将分离的ICM培养到MEF饲养层上，以使小鼠ES细胞保持未分化状态。使用这种小鼠ES细胞培养方案，直到发现细胞因子白血病抑 制因子（LIF）也能够将小鼠ES细胞维持在未分化状态，即使在完全不存在MEF饲养细胞的情况下。初始的人类ES细胞衍生和培养方法[3于1998年改编自以前开发的小鼠ES细胞衍生和培养方法。

为了建立和生长第 一个人类ES细胞系，使用有丝分裂灭活的MEF饲养层，初始培养基由Dulbecco改良的Eagle's培养基组成，辅以20％胎牛血清（FBS），1 mM谷氨酰胺，0.1 mMβ-巯基乙醇和1％的非需要氨基酸。从那时起，这种培养基组合物就被用作人类胚胎干细胞培养的基本配方，并在全世界无数的实验室中使用。然而，尽管这些培养条件足以使人ES细胞保持某种程度的未分化状态，但在人ES细胞的常规培养过程中也观察到了自发分化。

人胚胎干细胞与小鼠胚胎干细胞的区别在于维持其未分化状态所需的生长因子类型。如上所述，LIF可用于将小鼠ES细胞维持在未分化状态。但是，尚未发现人类LIF可以阻止人类ES细胞分化。为了开发一组较佳的人类ES细胞培养条件，首先重要的是确定维持未分化细胞状态所需的生长因子。例如，近期有人提出，TGFβ1信号传导可能是维持人类ES细胞未分化状态的先决条件。BMP信号转导的抑 制以及bFGF的处理对于人ES细胞的自我更新活性也可能很重要。

当前，没有建立的人ES细胞系被证明适合用作细胞替代疗法的直接来源。目前，绝大多数衍生细胞在治疗应用中都存在严重缺陷，这主要是由于它们依赖血清，饲养细胞以及人类ES细胞衍生和维持方法固有的动物来源化学物质。因此，许多科学家正在进行针对人类ES细胞衍生和培养条件的开发的研究，这些条件可以用人类来源的材料代替当前非人类来源的材料。

用于培养人ES细胞的基本方法的一项重大改进是开发了在无饲养层条件下或在无血清条件下与人类起源的饲养细胞一起培养人ES细胞的能力，其中使用了补充的血清替代品与bFGF。人ES细胞在MEF饲养层上的生长是异源性病原体从动物向人组织潜在转移的途径。由于大多数人类ES细胞系已在MEF存在下生长或衍生，因此这些细胞不适合用于治疗应用。例如，小鼠饲养细胞是非人类唾液酸Neu5Gc的来源，它可以在将人类ES细胞移植到患者体内时诱导免疫反应。

因此，如果人类ES细胞真实用于未来的治疗应用中，则需要在用于培养人类ES细胞的基本方法上进行进一步的改进。为了进行这种改进，Xu等人。很早报道人类人类ES细胞生长的无饲养层培养系统的发展。尽管该小组使用了无饲养层培养系统，该系统使用了来自MEF饲养层的条件培养基和含有bFGF的无血清培养基，但是由于这种培养方法不能完全消除动物病原体可能转移到人体组织的可能性。使用MEF条件培养基。但是，从那时起，几个小组报告了无饲养系统的开发。近期，Klimanskaya等成功地建立了人类ES细胞系，而无需使用任何饲养层。

除了开发用于维持人类ES细胞的无饲养层培养系统外，还进行了一些尝试在人类饲养层而非MEF饲养层上培养人类ES细胞。Hovatta等。报道使用人包皮成纤维细胞作为饲养层，而不是MEF。另一份报告使用人类饲养层和人类血清条件，建立了新的人类ES细胞株。Inzunza等。还报道了在血清置换条件下使用出生后的人成纤维细胞作为饲养细胞建立人ES细胞，而不是像过去那样利用FBS、Lee等。报道了在无血清条件下在子宫内膜组织来源的人类饲养细胞上分离和培养三种人类ES细胞系。然而，在无动物饲养者条件下建立的这些人类ES细胞的衍生涉及使用免疫外科方法进行ICM分离。因此，不可能声称完全不含动物病原体，因为免疫外科手术固有地具有动物病原体污染的风险，被用于分离ICM。

人ES细胞的适当维持和扩增也是人ES细胞研究中的重要问题。与小鼠ES细胞不同，对人类ES细胞的操纵是一个相对微妙的过程，尤其是扩展过程需要精湛的技能。已经利用各种技术来扩增已建立的人ES细胞。一些小组已经使用微量移液管或精细绘制的巴斯德移液管机械转移了人类ES细胞，而其他人则使用胶原酶，胰蛋白酶，然后分散进行扩展。近期，我们报道了用于有效扩增人ES细胞的方法，包括机械过程和酶处理，特别是用胶原酶IV处理。这些传输方法中的每一种都具有不同的优点和缺点。机械转移方法的优点在于不存在细胞解离酶，并且能够从分化细胞中分离未分化的人ES细胞。但是，该方法费力且费时，这使得同时处理多个电池非常困难。因此，该过程更适合维持人类ES细胞系。