培养成体干细胞和人多能干细胞的突变影响

未分化和专业化细胞的无限供给，成体干细胞和多能干细胞衍生类器官保持在再生医学的巨大潜力。此外，干细胞已成为药理学和毒理学无价工具用于体外测试。维持培养中基因组完整性是成功应用干细胞的前提，因为不需要的突变可能会影响药物反应和毒理学测量，或者可能导致移植后致癌性转化。

然而，多个研究已经确定复发性基因组改变源于常规培养的人的ASC和省电类别。尽管这些研究表明在培养中干细胞的基因组完整性降低了，但这些研究中的大多数已通过分辨率有限的方法在批量培养中进行。由于只能检测到大多数细胞中共有的突变，因此对大量样品的分析提出了重要的限制。这导致偏向那些赋予细胞选择性优势的基因组改变，或那些在培养过程中较早发生的改变，而培养过程本身的突变影响和负责任的突变机制仍不清楚。更好地了解培养中活跃的突变过程可能使我们能够通过改变培养条件来改善培养中的基因组稳定性。

我们近期建立了一种方法，该方法通过将全基因组测序（WGS）与体外克隆扩增相结合，以碱基对的分辨率准确地识别单个干细胞体内获得的体细胞突变。简而言之，将干细胞作为单细胞播种并繁殖以获得足够的细胞用于DNA分离和随后的WGS。进行生物信息学分析，以高可信度鉴定出原始细胞中存在的那些突变（单核苷酸变异，插入缺失，拷贝数变异，结构变异（SV）和非整倍性），并滤除单次杂交后发生的种系变异和亚克隆变异-cell步骤。用这种方法，避免了体外扩增方法的高噪声率，这使得每个基因组少于一百个突变的可靠检测成为可能。将所得的全基因组突变谱和分配已显示出提供新的见解在体内和CRISPR / Cas9编辑类器官中的成体干细胞的特定突变和DNA修复过程的活性。

在这里，我们采用了这种方法来系统地测量体外培养物对三种人干细胞类型的个体细胞的突变影响，这些人干细胞类型是根据药理学，毒理学和再生医学的相关性而选择的：PSC，肝ASC和肠道ASC。我们的研究表明，体外培养导致突变率提高，并留下了与氧化应激相关的独特但常见的突变足迹，而这种足迹与干细胞类型无关。此外，我们证明了在降低的氧气张力下培养可减少与氧化应激相关的突变量。我们使用测得的定量和定性突变特征来建模全基因组突变积累，并进行与干细胞的体外和体内应用相关的遗传风险评估。

其结果培养期间PSC和ASC中的突变积累，为了公正地研究标准培养条件对干细胞基因组的突变影响，我们首先建立了克隆人PSC和ASC品系。建立了一个多能胚胎干细胞系，两个诱导的PSC系，两个肝ASC系和两个肠道ASC系的克隆。每个克隆系培养约2–5个月（补充数据 ），在此期间允许积累突变。

随后，执行第 二个克隆步骤以生成所谓的亚克隆，这些亚克隆用于确定导致这些亚克隆的单个细胞中存在的突变。将克隆，亚克隆和匹配的非克隆参考样品进行WGS处理。从亚克隆中排除所有种系变体和在第 一步克隆之前积累的变体。根据低等位基因频率（VAF），通过生物信息学方法将第二个克隆步骤后体外产生的变体滤除。这种方法使我们能够专门测量在两个克隆步骤之间的培养期间累积的突变。

在特定数量的群体倍增后，可以实现特定应用（例如细胞疗法或药物研究）所需的干细胞总数，该倍数由细胞分裂率和细胞死亡率决定。因此，从实际的角度来看，关于每群体倍增的突变率的知识比每时间单位的突变数更具信息性。因此，我们确定了在相同条件下所有细胞类型的种群倍增率，这些条件也用于突变积累实验。我们发现人类PSC的种群倍增时间约为23小时，这大约是人类肝脏和肠道ASC种群倍增时间分别约为46和44h的两倍。

通过测序读取深度覆盖范围分析了所有三种干细胞类型的所有克隆和亚克隆的核型，发现它们是正常的，没有任何明显的染色体异常。总共，我们在15个亚克隆中检测到283个小插入和缺失（indels）。在不同的干细胞类型之间，每个群体每个基因组中每个基因组的插入缺失数量没有统计上的显着差异（ANOVA，p ?= 0.15）。基因组分布分析显示，插入缺失对CDS没有影响，但人类胚胎干细胞系亚克隆中一个插入缺失导致CDKN1C移码突变。

我们确定了15个亚克隆所共有的4,517个单碱基对取代（SBS）。肝ASCs每个群体每个基因组获得8.3±3.6 SBS的数量加倍。在肠道ASC中，突变积累率与每个群体每个基因组7.2±1.1 SBS加倍相似。PSC中的SBS数量比ASC中的SBS数量少，每个群体每个基因组的基因组突变有3.5±0.5倍（ANOVA，p ?= 0.006）。为了与体内突变率进行比较，我们还计算了两种ASC类型每年的突变率。单个肠道ASC每年积累1415±212个突变，肝干细胞每年积累1588±679个突变。这些值比每年大约40 SBS的体内突变积累率高近40倍。这些发现表明标准的体外培养条件对突变积累率有很大的影响。

对于所有三种干细胞类型，SBS的基因区域均被大量消耗。消耗不限于蛋白质编码序列，还包括非编码序列，表明基因区域中的消耗主要是由于基因区域中增强的修复活性而不是通过针对有害突变的选择引起的。在所有三种干细胞类型中，编码序列的消耗约为2％。总共，我们在所有样本中鉴定出19个非同义突变，PSC中有8个，肝ASC中有2个，肠ASC中有9个。根据人类癌症基因普查，这些非同义词突变均未影响已知的癌症基因或之前已描述在培养物中，以赋予在干细胞的选择性优势。

在启动子区中的突变可影响基因的活性，从而有助于疾病。在所有三种干细胞类型的启动子或启动子侧翼区域中，特别是在肠道ASC中，突变都被消除了。通常认为异染色质的突变是无害的，因为影响功能元件的风险很低。在所有三种干细胞类型中，突变都显着富集于异色层粘连蛋白相关结构域，重编程过程中出现的突变就是这种情况。因此，在所有三种干细胞类型中，功能相关的基因组区域似乎更不受突变积累的保护，而异色LAD更易于突变积累。